PCR儀的操作與維護

今天來給大家整理下pcr實驗操作注意事項及常見問題、維護指南。

簡單的說，PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。

目前，常用的技術，可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。根據DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。

實驗操作注意事項：

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意： 

1.戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套； 

2.使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 

3.避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 

4.操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度； 

5.而后加入反應模板，加入后蓋緊反應管； 

6.操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性； 

7.盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，建議使用可替換或高壓處理的加樣器。

如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區； 

8.重復實驗，驗證結果，慎下結論。

具體歸類為以下常見的4點，描述如下：問題一：無擴增產物

現象：正對照有條帶，而樣品則無

原因：

1、模板:含有抑制物，含量低

2、Buffer對樣品不合適

3、引物設計不當或者發生降解

4、反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短

對策：

1、純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量

2、更換Buffer或調整濃度

3、重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物

4、降低退火溫度、延長延伸時間

問題二：非特異性擴增

現象：條帶與預計的大小不一致或者非 特異性擴增帶

原因：

1、引物特異性差

2、模板或引物濃度過高

3、酶量過多

4、Mg2+濃度偏高

5、退火溫度偏低

6、循環次數過多

對策：

1、重新設計引物或者使用巢式PCR

2、適當降低模板或引物濃度

3、適當減少酶量

4、降低鎂離子濃度

5、適當提高退火溫度或使用二階段溫度法

6、減少循環次數

問題三：拖尾

現象：產物在凝膠上呈Smear狀態

原因：

1、模板不純

2、Buffer不合適

3、退火溫度偏低

4、酶量過多

5、dNTP、Mg 2+濃度偏高

6、循環次數過多

對策：

1、純化模板

2、更換Buffer

3、適當提高退火溫度

4、適量用酶

5、適當降低dNTP和鎂離子的濃度

6、減少循環次數

問題四：假陽性

現象：空白對照出現目的擴增產物

原因：

靶序列或擴增產物的交叉污染

對策：   

1、操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；

2、除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。

3、各種試劑建議先進行分裝，然后低溫貯存

儀器的維護保養

需要注意以下問題：

實驗室使用的基因擴增儀，熒光定量PCR儀都是高精度儀器。一旦儀器出現一些溫度或者檢測上的小偏差，則很可能對實驗結果產生較大的影響。因此，學會日常保養和維護是尤為重要的。

1、儀器安置

 儀器應安放在濕度較低、灰塵較少并遠離水源和熱源的地方，無腐蝕性氣體或強磁場干擾。

環境溫度建議在18~35℃之間。儀器之間應保持50cm 以上距離，降低儀器之間的影響。

2、樣品臺、熱蓋定期清潔

用95%乙醇配合棉簽、無塵布等工具，清潔樣品臺。之后運行PCR儀，設定保持溫度為50℃，約5~10min，讓殘余液體揮發去除。

另外，熱蓋也應該用酒精或純水定期清洗，確保熱蓋清潔，溫控性能良好。對于熒光定量PCR，清潔樣品臺和熱蓋的同時，去除灰塵等雜物，保證光路清潔，降低信號干擾。

3. 使用前預熱

老款的PCR儀的性能比不上新款儀器，使用前需要進行預熱，不僅對儀器維護有好處，還能節約實驗時間。新款的儀器升溫快，但還是建議能在進行實驗前預熱2min，這樣可以有效延長儀器的使用壽命。

4. 定期運行維護

1.PCR儀器需要定期檢測，視制冷方式而定一般半年至少一次。

2.PCR反應的要求溫度與實際分布的反應溫度是不一致的，當檢測發現各孔平均溫度差偏離設置溫度大于1～2℃時，可以運用溫度修正法糾正PCR實際反應溫度差。

3.PCR反應過程的關鍵是升、降溫過程的時間控制，要求越短越好，當PCR儀的降溫過程超過60s，就應該檢查儀器的制冷系統，對風冷制冷的PCR儀要較徹底地清理反應底座的灰塵；對其他制冷系統應檢查相關的制冷部件。

4.一般情況如能采用溫度修正法糾正儀器的溫度時，不要輕易打開或調整儀器的電子控制部件，必要時要請專業人員修理或利用儀器電子線路詳細圖紙進行維修